摘要
目的：建立測定氧化苦參堿血藥濃度的HPLC法。
內(nèi)容
方法：血漿標(biāo)本經(jīng)堿化以氯仿一正丁醇(98∶2)提取，吹干后以甲醇一正己烷(4∶1，氨水調(diào)pH至8)為流動相，經(jīng)過Spherisorb－SiO
2(5 μm)柱分離后在紫外220 nm處檢測。
結(jié)果：氧化苦參堿血漿濃度曲線范圍1.2～36 mg
.L
-1，最低檢出限為0.1 mg
.L
-1(S/N=2)。樣品在1.2～36 mg
.L
-1濃度時(shí)的平均回收率為98.31 %～109.0%，日內(nèi)和日間精密度的RSD均小于4 %。
結(jié)論：此方法為氧化苦參堿的血藥濃度測定及藥代力動學(xué)研究提供了一種簡便可行的方法。
氧化苦參堿是從豆科槐屬植物苦豆子(Sophora alopecuroides L.)及苦參(Sophora flavescens Ait.)根中提取分離得到的一種雙稠哌啶衍生物?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明氧化苦參堿具有抗心率失常、抗炎、抗腫瘤等作用［1，2］。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道氧化苦參堿血藥濃度的測定方法有離子對比色法［3］、毛細(xì)管氣相色譜法［4］等，本文用高效液相色譜法測定了人血漿中的氧化苦參堿含量，此方法具有專屬性強(qiáng)、血漿用量少、檢測靈敏度高、測定穩(wěn)定性好、快捷方便等特點(diǎn)。
1 儀器與試藥
LC－10A高效液相色譜儀，SPD－10A紫外檢測器，C－R7Ae色譜數(shù)據(jù)處理器(日本島津)；FZQ－2型旋渦混合器；LN－9527－01型高速離心機(jī)(美國雅培公司)。
氧化苦參堿對照品：批號為0780－9703(中國藥品生物制品檢定所提供，丙酮重結(jié)晶后使用)。甲醇、己烷為色譜純，其余試劑均為分析純。
氧化苦參堿對照品儲備液：精密稱取氧化苦參堿適量，用水溶解制成濃度為200 mg.L-1的溶液，置4 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?br />
受試者：4名，年齡22～25歲，體重76～90 kg，均為健康男性。
2 色譜條件
Spherisorb－SiO2不銹鋼柱(250 mm×4.6 mm)5 μm；流動相：甲醇一正己烷(4∶1)，每100 mL加28 %氨水1.2 mL。流速：2.0 mL.min-1；檢測波長：220 nm。
3 血漿樣品處理
精密吸取血漿樣品0.5 mL，置10 mL離心管中，加入0.8 mol.L-1高氯酸1.0 mL，混旋振蕩1 min，離心5 min(3000 r.min-1)，將上清液全部轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中，加入20 %氫氧化鈉溶液0.35 mL，用氯仿－正丁醇混合液(98∶2) 3 mL混旋振蕩提取2次，每次2 min，離心3 min(3000 r.min-1)，合并有機(jī)相，在70 ℃水浴中氮?dú)獯蹈桑瑢埩粑餃?zhǔn)確用200 μL甲醇溶解，離心3 min(10000 r.min-1)，取20 μL進(jìn)樣分析，血漿色譜圖見圖1。
4 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備
精密吸取健康人空白血漿0.5 mL，共7份，置7支10 mL離心管中，定量加入氧化苦參堿對照品儲備液，使其濃度分別為1.2、2.4、4.8、7.2、12.0、24.0、36.0 mg.L-1，按“樣品處理方法”項(xiàng)下操作，進(jìn)行色譜分析，以氧化苦參堿峰面積A對濃度C(mg.L-1)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：
A=12912.65C-5426.69 r=0.9999 n=3
當(dāng)S/N=2時(shí)，最低檢出濃度為0.1 mg.L-1。
A. 空白血漿 B.氧化苦參堿血漿樣品
1.氧化苦參堿(11.2 min)
5 回收率試驗(yàn)
分別于0.5 mL空白血漿中定量加入氧化苦參堿對照品儲備液，使其濃度分別為1.2、4.8、12.0、36.0 mg.L-1，按“樣品處理方法”項(xiàng)下操作，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算求得的血藥濃度與實(shí)際濃度之比即為本方法的回收率。結(jié)果見表1。
6 精密度試驗(yàn)
分別在“回收率試驗(yàn)”項(xiàng)下4種血藥濃度水平上進(jìn)行日內(nèi)與日間(5 d)精密度考察。
7 穩(wěn)定性試驗(yàn)
取正常人空白血漿5 mL，定量加入氧化苦參堿對照品儲備液，使其濃度為4.8 mg.L-1，分為三組，每組三管，每管0.5 mL。第一組立即處理并測定；第二組立即處理后殘?jiān)?20 ℃冰箱1周后測定；第三組血漿樣品置-20 ℃冰箱1周后處理并測定。結(jié)果表明，第二、第三組相對第一組的含量分別為98.8 %和102.5 %，表明氧化苦參堿穩(wěn)定性良好。
8 樣品測定
4位健康志愿者肌肉注射氧化苦參堿注射液300 mg，給藥后的5、10、20、30、40、60、90、120 min定時(shí)靜脈取血2 mL。分離血漿，取0.5 mL按“血漿樣品處理”項(xiàng)下操作，測定氧化苦參堿含量，以給藥時(shí)間為橫坐標(biāo)，血漿中的氧化苦參堿濃度的對數(shù)為縱坐標(biāo)繪制藥時(shí)曲線
9 討論
本文曾采用C18柱及氨基鍵合柱作為分離柱，以甲醇、水、乙腈等作為流動相，試圖對氧化苦參堿血漿樣品進(jìn)行分離，但均未取得成功，最終以硅膠柱為分離柱，甲醇—己烷(4∶1)為流動相，獲得了理想的分離及峰形。流動相中適當(dāng)加入氨水可以很好地改善氧化苦參堿的峰形。 氧化苦參堿極性較大，很難被有機(jī)溶劑提取，在強(qiáng)堿性條件下以游離堿形式存在時(shí)在氯仿中具有較好的溶解性，因此我們采用了氯仿—正丁醇混合液提取法，結(jié)果十分理想。用高氯酸沉淀血清蛋白后，氫氧化鈉溶液的加入量是影響氧化苦參堿提取率的關(guān)鍵因素，實(shí)際測定中，20 %氫氧化鈉的加入量超過0.30 mL時(shí)氧化苦參堿的提取率較高。
有人曾用三氯醋酸作為血清樣品提取前的蛋白沉淀劑［5］。在本實(shí)驗(yàn)條件下采用它，血清峰較復(fù)雜，對氧化苦參堿的分離有干擾，所以我們用高氯酸作為蛋白沉淀劑，結(jié)果滿意。
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